蛋白质检测 *** （蛋白质浓度测定常用的三种 *** ）测定蛋白质浓度的 *** 有很多，科研工作者广泛使用的 *** 比如紫外吸收法，双缩脲法，BCA *** ，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等等 ，今天小编以UV法，BCA法，考马斯亮蓝法，其中的三种 *** 的测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项做详细介绍。

蛋白质检测 *** （蛋白质浓度测定常用的三种 *** ）

UV法

这种 *** 是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算 *** ，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量 *** ，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor

（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：

蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d为测定OD值比色杯的厚度

D为溶液的稀释倍数

BCA法

原理BCA（bicinchonininc acid）与二价铜离子的 *** 铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562 nm 下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

BCA 蛋白浓度测定试剂盒，Abbkine的蛋白质定量试剂盒（BCA法）提供一个简单，快捷，兼容去污剂的 *** ，准确定量总蛋白。

成分试剂 A100 mL试剂 B2 mL标准蛋白（BSA）1 mL×2，1 mg/mL

保存条件运输温度：室温（标准蛋白 4～8 ℃ 运输）

保存温度：室温（标准蛋白 -20 ℃ 保存）

有效日期：12 个月

使用 ***

*** 一：96 孔板

1. 配制 BCA 工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液。充分混匀。

2. 将蛋白标准品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到 10 μL。取 10 μL 待测样品加入 96 孔板的待测样品孔中。每个测定要做 2～3 个平行。

3. 向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即样品与工作液的体积比为 1:20），混匀。

4. 37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。

5. 酶标仪 562 nm 波长下测定吸光度。

6. *** 标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。

蛋白质浓度测定常用的三种 *** （详解）
*** 二：试管法

1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做 2～3 个平行。本处列举的比色体系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。

2. BSA 标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备 3 个平行测定。标准曲线一般 5~6 个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA 时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 标准品、样品及 BCA 工作液。

3. 取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。

4. 将样品与标准品在 562 nm 波长下测定吸光度。

蛋白质浓度测定常用的三种 *** （详解）
考马斯亮蓝法

实验原理考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的 *** 。这种蛋白质测定法具有超过其他几种 *** 的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一 *** 是也灵敏度更高的蛋白质测定法之一。

考马斯亮蓝 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的更大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。

突出优点（1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其更低蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性更好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和需要严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。

缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在 *** 标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基 *** 钠 (SDS) 等。

试剂与器材1、试剂考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL。

2、标准和待测蛋白质溶液（1）标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。

（2）待测蛋白质溶液。人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。

3、器材试管 1.5×15 cm（×6），试管架，移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。

操作 *** 一、 *** 标准曲线取 7 支试管，按下表平行操作。

摇匀，1 h 内以 0 号管为空白对照，在 595 nm 处比色。

绘制标准曲线：以 A595 nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定测定 *** 同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

注意事项（1）在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

（3）利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净， *** 蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品更好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。